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Western blotting检测试剂盒(ECL发光)

Western blotting检测试剂盒(ECL发光)

简要描述:货  号:P1060
名  称:Western blotting检测试剂盒(ECL发光)
规  格:10T
价  格:860.00

产品型号:

所属分类:其他自产即用试剂

更新时间:2016-12-19

厂商性质:经销商

详情先容

Western blotting ECL发光法检测试剂盒

 

P1060

Western blotting(小鼠IgG)ECL发光法检测试剂盒

860

P1070

Western blotting(兔IgG)ECL发光法检测试剂盒

860

P1080

Western blotting(山羊IgG)ECL发光法检测试剂盒

860

 

 

试剂盒内容:
1. 封闭试剂:30g(可配制400ml)脱脂奶粉及其他蛋白,缓冲盐等混合物。
2. 10倍浓缩抗体稀释液,50ml。
3. HRP标记二抗,0.1ml,效价1:2000-5000。
4. ECL显色液,25mlA+25mlB。

试剂盒原理:
SDS-PAGE电泳后,蛋白质按照分子量大小分离,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)后,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶标记的第二抗体起反应,加入发光底物后,能让胶片感光。zui后经显影和定影后,可以在胶片上显示出条带来(抗原所在位置)。 

操作步骤:
常规电泳转膜后,
1. 清洗转印膜:将膜剥离下后,作好标记,一般在左上角剪一缺口。室温用TBS-T漂洗3次每次5min,以尽量洗去转印膜上的SDS,防止影响后面的抗体结合。
2. 按5g封闭试剂加100ml双蒸水计,配制膜封闭液,配好的膜封闭液为乳白色悬液,将漂洗过的转印膜,封闭液内,摇床震动,室温封闭30min。用TBS-T ,PH7.6洗液,室温漂洗3次每次5min。
3. 将10×抗体稀释液用双蒸水稀释成1×(10ml  10×抗体稀释液加入90ml双蒸水,混匀,可4℃保存三个月)。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。
4. 用1×的抗体稀释液稀释抗体。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜放入杂交袋中,加入一抗工作液,封口,4℃孵育过ye或37℃摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。注:如果所加一抗不同,可在此步将膜沿电泳方向剪成条,分别作好标记,分开孵育。
5. 用TBS-T ,PH7.6洗液,室温漂洗3次每次5min。
6. 用稀释好的抗体稀释液稀释二抗。根据用量,按10ml抗体稀释液加入5ulHRP标记二抗的比例,配制二抗工作液。将杂交膜放入杂交袋中,加入二抗工作液,封口, 37℃摇动孵育1h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。
7. 用TBS-T ,PH7.6洗液,室温漂洗3次每次10min。
8. 配制ECL发光液:根据用量,取ECL发光液A、ECL发光液B各等量,混匀,加在膜正面,暗室显色5分种。先倾去显色液,再小心用纸吸去显色液,在上面盖一层平整的透明纸。再取出感光胶片,做好标记,轻轻的放在膜上,请小心不要错动(余下的胶片请收好)。显色30S到1分种,取出(直接上抬)胶片马上完全浸入显影液中1-2min,再丢入定影液中1分钟,离开暗室,观察结果,根据条带强弱,可再次感光一次,并且减短或者加长感光时间(从5秒到30分钟)以期达到理想结果。 

注意事项:
1. 请根据一抗来源选择试剂盒。而不是标本来源来洗择。因为二抗是与一抗反应而不是与标本反应。
2. western blotting ECL发光法操作比较烦琐,但其敏感性较高,对于低丰度蛋白也能显示出结果。
3.可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深,可延长膜封闭时间,加长zui终漂洗次数与时间。如果条带过弱,可增加抗体浓度,延长抗体孵育时间,加长感光时间。
4. TBS-T(0.01M)配制方法:称取NaCl 8.5g ,Tris 1.21g ,用800ml的双蒸水溶解,用盐酸调PH到7.6,再加入0.5ml Tween-20,用双蒸水 加至1000ml,混匀即可。(也可按照自己的配制习惯来配制)
如果实验结果无条带,可将稀释过的一抗再作1倍,10倍,50倍稀释,直接点到膜上(10ul),封闭,加二抗,zui后显色,如果能显出斑点来,则证明显色系统没有问题,可从蛋白裂解和一抗上面找原因;如果无法显出,请先从显色系统寻找原因。



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