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Western blotting检测试剂盒(DAB)

Western blotting检测试剂盒(DAB)

简要描述:货  号:P1050
名  称:Western blotting检测试剂盒(DAB)
规  格:10T
价  格:860.00

产品型号:

所属分类:其他自产即用试剂

更新时间:2016-12-19

厂商性质:经销商

详情先容

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试剂盒组成
1. 封闭试剂:30g(可配制400ml)脱脂奶粉及其他蛋白,缓冲盐等混合物。
2. 10倍浓缩抗体稀释液,50ml
3. HRP标记二抗,0.5ml,效价1400
4. DAB显色液(20×),5ml A+5ml B

原理:

SDS-PAGE电泳后,蛋白质按照分子量大小分离,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)后,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶标记的第二抗体起反应,经过底物显色以检测电泳分离的特异性的蛋白。

操作步骤:

常规电泳转膜后,
1) 清洗转印膜:将膜剥离下后,作好标记,一般在左上角剪一缺口。室温用TBS-T漂洗3次每次5min,以尽量洗去转印膜上的SDS,防止影响后面的抗体结合。
2) 5g封闭试剂加100ml双蒸水计,配制膜封闭液,配好的膜封闭液为乳白色悬液,将漂洗过的转印膜,封闭液内,摇床震动,室温封闭30min A@ 3) TBS-T PH7.6洗液,室温漂洗3次每次5min
3)将10×抗体稀释液用双蒸水稀释成1×(10ml 10×抗体稀释液加入90ml双蒸水,混匀,可4℃保存三个月。此稀释液可作为一抗和二抗的稀释液。
4)用1×的抗体稀释液稀释抗体。根据用量以及一抗的推荐稀释浓度来稀释一抗。将杂交膜放入杂交袋中,加入一抗工作液,封口,4孵育过ye或37摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。注:如果所加一抗不同,可在此步将膜沿电泳方向剪成条,分别作好标记,分开孵育。
5)用TBS-T PH7.6洗液,室温漂洗3次每次5min
6)用稀释好的抗体稀释液稀释抗体。根据用量,按10ml抗体稀释液加入10ulHRP标记二抗的比例,配制二抗工作液。将杂交膜放入杂交袋中,加入加入二抗工作液,封口,4孵育过ye或37摇动孵育2h。此用过的抗体一般可回收第二天再使用一次。
7)用TBS-T PH7.6洗液,室温漂洗3次每次10min
8)配制DAB显色:根据用量,取TBS-T  4ml,加入DAB显色液ADAB显色液B200ul,混匀,加在膜正面,室温下显色。在目标条带显出后,而且背景未出时,放入水中终止显色。

注意事项:
1,   请根据一抗来源选择试剂盒。括号里面代标一抗的来源而不是标本的来源。
2,   western blotting DAB显色法操作简单,但其敏感性与ECL发光发有一定的差距,一般只适用于丰度较高的蛋白。
3,   可以根据显色结果来优化实验反应时间。如背景过深,可延长膜封闭时间,加长zui终漂洗次数与时间。如果条带过弱,可延长抗体孵育时间。
4,   如果完全没有条带,请检查前期蛋白处理及实验过程, 如果确认无误,反复两次依旧无结果,请换用ECL发光法显色。
5,   TBS-T0.01M)配制方法:称取NaCl 8.5g Tris 1.21g ,用800ml的双蒸水溶解,用盐酸调PH7.6,再加入0.5mlTween20,用双蒸水 加至1000ml,混匀即可。(也可按照自己的配制习惯来配制)



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