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去内毒素质粒DNA提取试剂盒

去内毒素质粒DNA提取试剂盒

简要描述:货  号:D0003
名  称:去内毒素质粒DAN提取试剂盒
规  格:50T/200T
价  格:180/480

产品型号:

所属分类:其他自产即用试剂

更新时间:2016-12-21

厂商性质:经销商

详情先容

去内毒素质粒DAN提取试剂盒

 

试剂盒组成

50T

200T

保存温度

RNaseA10mg/ml

400ul

2ml

-20

溶液

10ml

40ml

RT

溶液

10ml

40ml

RT

溶液

10ml

40ml

RT

内毒素清除剂

25ml

100 ml

2-8

结合液

30 ml

120 ml

RT

玻璃奶

1ml

4ml

RT

TE缓冲液

10ml

30ml

RT

 

原理概况

本试剂盒在常规质粒提取试剂盒的基础上改进而来,增加内毒素清步骤,提取的质粒可用于一些要求更高的实验,如转染。
本试剂盒(以200T为例)可以用200小次或者*次提取。

注意事项
1溶液低温时可能出现析出和沉淀,可以37度水浴几分钟即可恢复澄清透明。用完请及时盖紧盖子。
2.
溶液Ⅰ中加入RNase 后请放2-8度保存,如果长久不用(如一个月),可-20度冻存,或者按照比较分次加入。
3.可根据实验情况中量或者大量提取,加入的试剂等比放大。
4内毒素清除剂在常温下出现面混浊现象,为正常,在2-8℃放置一段时间混浊会消失。
5.本试剂盒在去除内毒素的过程中会损失少量质粒,因而相对于常规提取,本试剂盒得率偏低。

操作步骤(以小量提取为例,中提或者大提可等比例加入)
溶液Ⅰ中加入RNaseA,混匀,28度保存。
1.取过ye菌1-5毫升,5000g离心1分钟收集细菌沉淀,弃上清(可重复多次收集于一管中,收集量可考虑菌液浓度与质粒拷贝数),如为阳性细菌,可加入100mg/ml的溶菌酶悬浮菌液,37度处理30分钟,离心,收集沉淀。
2.在收集的菌液中,加入200ul溶液I,重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开,无可见细菌团块(可vortex 5-10秒或更长时间)。室温放置2-3分钟。
3.每管加入200ul溶液(如有沉淀,可37度水浴),轻轻颠倒离心管4-6次,使细菌完全裂解,溶液透明。放置2-3分钟,不过超过5分钟。但也不要混匀后立即加入溶液Ⅲ。
4.放置2-3分钟后,每管加入200ul溶液III,随即颠倒离心管4-6次混匀,可见白色絮状物产生。
5zui高速(13,000rpm左右)室温离心5分钟。
6.将上清转移到新的离心管中,如有沉淀,可再次离心。
7.加入上清1/5体积冰预冷的内毒素清除剂,振荡混匀,溶液变浑浊,冰浴2min至溶液变清亮。
8.37℃水浴2min,不时振荡,溶液又变浑浊。12000rpm室温离心2min,溶液应分为两相,上层水相含质粒DNA,下层油状相含内毒素。
9.将含质粒DNA的上层水相转移至新管,弃下层油状相,注意不要吸入油状相。重复抽提三次,即重复步骤7-9三次。
10.在得到的上清中加入等体积的结合液,再加入等体积的无水乙醇,混匀(上清:结合液:无水乙醇=1:1:1
11.玻璃奶摇匀。取20ul混匀的玻璃奶加入上面的混合液中,混匀。室温放置5分钟,期间颠倒2次。
12.10000转/分钟离心1分钟,倒掉上清;沉淀加入1ml 70%乙醇,振荡混匀,10000转/分钟离心1分钟,去上清,70%乙醇重复洗一次,再用无水乙醇洗一次。去上清,再次离心2分钟,用小吸头吸去上清。
13.室温放置10分钟(如果为大提,请延长放置时间到30分钟,此步为去除残余酒精,以免影响下游实验),加入3050ulTE缓冲液混匀溶解,55℃水浴5分钟。离心,取上清转移到一新的离心管中。此为所提质粒。
14.电泳或者其他方法检测,进入下游实验。



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